重组Reg2蛋白的构建及表达与纯化文献综述

 2023-01-31 10:01

开题报告内容:(包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述,不少于2000字)

拟研究或解决的问题:

Reg2基因蛋白作为一种重要的钙样凝集素(C-type lectin)超家族蛋白,能够刺激细胞增殖和新生。本研究拟通过构建重组Reg2基因蛋白的表达菌,经处理以获得纯化复性的蛋白,并通过将其作用处理胰岛素瘤细胞系MIN6细胞,来初步探究其生理活性。

采用的研究手段:

(1)全胰岛mRNA提取

选取C57B/L6纯小鼠,麻醉后打开腹腔,获取胰腺组织少许,置于含有1ml Trizol的试管,冰上组织匀浆机匀浆20秒,室温放置5min。12000rpm 离心5min,取上清,加1ml氯仿,混匀后室温放置15min。4℃ 12000g离心15min。吸上层水加入1ml异丙醇混匀,室温放置5-10min。 4℃ 12000g离心10min,弃上清, 加入1ml 75%乙醇,悬浮沉淀。 4℃ 8000g离心5min,弃上清,无菌操作台通风干燥5-10min。100l RNase Free H2O溶解RNA样品。-80℃保存。

(2)mRNA逆转录cDNA

移液器吸取1g mRNA转移至PCR管中,进行DNA Wipeout和逆转录操作。整个过程应保持低温和RNase Free环境。

(3)PCR扩增Reg基因cDNA

以逆转录产物cDNA为模板进行PCR反应,扩增Reg2编码DNA序列。PCR反应体系准备完毕后置于PCR仪中,PCR反应程序为:94℃ 3min,35个循环的 (94℃ 15sec, 60℃ 30sec, 72℃ 1min) ,最后72℃ 2min结束反应。产物取10 l通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。

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