重组Reg3α的制备及其活性鉴定文献综述

 2023-01-15 03:01

开题报告内容:

.课题背景

胰岛再生源蛋白(regenerating islet-derived protein, Reg)又称为胰石蛋白或胰腺相关蛋白,属于Ca依赖的植物血凝素超家族,可在人体多种组织中表达。大量研究表明Reg蛋白在组织损伤修复、治疗胰腺炎、抗肿瘤以及神经系统损伤修复中发挥重要作用。Reg蛋白家族包含多个成员,根据其基因编码蛋白的一级结构可分为I、II、III、IV四种亚型。其中II型蛋白仅存在于小鼠体内,而I型、II型、IV型蛋白在人、小鼠及大鼠体内均有发现,且I型蛋白有alpha;、beta;两种,III型蛋白有alpha;、beta;、gamma;、delta; 四种。

研究表明RegⅢ蛋白在胰腺损伤修复及治疗胰腺炎中有显著作用。本课题将以RegIIIalpha;为主要研究对象在已构建pET28a-Reg3alpha; T7 E.coli原核表达菌后对其进行表达纯化与活性测定。为后期RegIIIalpha;功能验证奠定基础。

.实验思路

RegIIIalpha;原核表达载体构建成功后,对菌种进行不同条件培养并进行菌液SDS-PAGE电泳检验,摸索合适的表达条件,实现RegIIIalpha;蛋白包涵体在大肠杆菌中的过量表达。并通过细菌裂解、亲和层析纯化以及透析复性等手段获得有活性的RegIIIalpha;蛋白,对该蛋白产物进行活性检测。

可能涉及的研究手段:聚合酶链反应、琼脂糖凝胶电泳技术、质粒的提取、感受态细胞的制备、菌株转化及鉴定、菌种的扩大培养、包涵体蛋白的提取、SDS-PAGE技术、分子筛技术、凝胶层析技术、镍离子亲和层析色谱、梯度透析复性技术等。

.实验方案

1.重组RegIIIalpha;包涵体的表达与提取

工程菌构建完成后,经过扩大培养和IPTG诱导表达重组蛋白。通过裂解细胞和离心方法提取目的蛋白包涵体。实验中为了进一步除去包涵体中混有的菌体碎片以及杂蛋白,可通过用不同浓度尿素溶液对包涵体洗涤的方法,最大程度的避免杂蛋白引入亲和层析。确定最佳实验条件后将蛋白样品溶解继而进行后续实验。

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