NDM-1酶及其突变体的分子动力学研究文献综述

 2023-01-07 01:01

一、背景介绍:

众所周知,beta;-内酰胺类抗生素(包括:青霉素类,头孢菌素类和单环beta;-内酰胺类等)是临床应用最为广泛的一类抗生素。但是目前beta;-内酰胺类抗生素面临着严峻的细菌耐药性问题[1,2]。

细菌对beta;-内酰胺类抗生素产生耐药性的方式主要有:⑴产生细胞膜渗透性屏障;⑵产生新的PBP(青霉素结合蛋白)或降低原有PBP对药物的亲和力;⑶产生beta;-内酰胺酶。其中beta;-内酰胺酶的产生被认为是最为重要原因[2]。

已发现的beta;-内酰胺酶数量非常之多(至2010年已达约900种,且每年新发现的数量在100种左右)[3],目前通常按照酶蛋白的氨基酸序列的相似性将其分为4大类(A、B、C和D)[3]。其中A、C、D三类需要丝氨酸残基来产生水解活性,故被统称为丝氨酸beta;-内酰胺酶(serinebeta;-lactamses);B类则通常依赖于一至两个Zn离子来产生活性,故被称为金属beta;-内酰胺酶(metallo-beta;-lactamses,MBLs)[3,4]。MBLs能够水解几乎所有的beta;-内酰胺类抗生素,且临床上尚无有效的抑制剂[5]。同时,由于许多带有MBLs基因的质粒有很高的迁移性,使得MBLs在世界范围内得以广泛传播,并对公众的健康造成了严重的威胁[6]。

最近几年,从部分超级细菌中陆续发现的一种被称之为新德里金属beta;-内酰胺酶-1(NDM-1)的酶便是MBLs中的一种。该酶能够水解除氨曲南(一种单环beta;-内酰胺类抗生素)外几乎所有的beta;-内酰胺类抗生素,且临床应用的所有beta;-内酰胺酶抑制剂(如:克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦等)均对其无效[7]。通过对NDM-1的氨基酸测序,序列比对以及晶体结构分析,其被进一步归类为B1类[8](B类分为1、2、3三个亚类[9])。与绝大多数B1类酶相同,NDM-1的活性中心中也有2个Zn离子,其中Zn1与His120、His122、His189配位,Zn2与Asp124、Cys208、His250配位[10]。尽管已有大量的研究,但NDM-1水解beta;-内酰胺环的准确机制尚无法确定[7],目前已知:⑴两个Zn离子以及其间的水分子或氢氧根离子直接参与beta;-内酰胺环的水解[11,12];⑵与Zn离子配位的氨基酸残基对Zn离子起了固定的作用[11,13];⑶其他氨基酸残基,如:Ile35、Leu65、Met67、Val73、Try93、Gln123、Thr190、Lys211、Lys216、Gly219、Asn220、Asp223等很可能与一种或多种底物或其水解产物有重要的相互作用,但多数残基的具体的作用机理仍未被充分研究[14-16]。

晶体结构复合物(PDB:3Q6X)表明,Gln123的侧链与氨苄的水解产物形成氢键。Gln123作为His122与Asp124之间的氨基酸,我们推测其对NDM-1的活性有很大的影响。本实验室之前已经对Gln123的作用进行了一些实验研究。通过定点突变的方法将123位的Gln突变为Ala(即构建Q123A突变体),测定了野生型NDM-1和Q123A突变体对不同抗生素的水解动力学参数(包括Km,kcat)。实验发现:Q123A突变体对氨苄西林的水解常数(kcat)和水解效率(kcat/Km)均较野生型有显著的下降;但突变体对于美洛培南的kcat和kcat/Km均有明显的上升。

本实验计划通过分子动力学模拟的方法,分别模拟野生型NDM-1和Q123A突变体对氨苄西林和美洛培南的分子动力学过程,分析其动力学过程的差异,研究Gln123和Ala123残基对酶分子以及底物或水解产物的影响,解释现有的实验现象,并期望对Gln123在酶分子中的作用提出一些合理的解释。

二、拟研究的问题:

1.研究野生型NDM-1对氨苄西林、美洛培南及两者水解产物的分子动力学过程。

2.研究Q123A突变体对氨苄西林、美洛培南及两者水解产物的分子动力学过程。

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