重组单纯疱疹病毒蛋白的纯化及鉴定文献综述

1. 立题背景

单纯疱疹病毒HSV属于疱疹病毒科a病毒亚科，病毒质粒大小约180纳米。在性病医院临床上根据抗原性的差别目前把该病毒分为1型和2型。1型主要由口唇病灶获得，2型可从生殖器病灶分离到。感染是由于人与人的接触。从发生后四个月到数年被感染的人数可达人口总数的50—90%，是最易侵犯人的一种病毒，但在临床仅有一部份发病。此病可分为：口唇性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、阴部疱疹、卡波西病等，有时也是脑膜炎、脑炎的病因。

HSV2病毒能引起生殖器疱疹。

HSV2主要因性行为传播，生殖器接触而感染，所以HSV2则常潜伏在骶神经节内，故临床主要表现为生殖器疱疹。患者血清学均为阳性，可终生有泌尿生殖道HSV病毒间歇性活动。

感染最初阶段，病毒先在神经节及与之相接触的神经组织内复制，然后通过感觉神经到达其未稍而使与之相关的皮肤、粘膜表面发生皮损。病毒从外周感觉神经扩散到皮肤、粘膜，这一情况，可以解释表皮大面积受感染和远离原发部位新病损发生的原因。

原发性HSV感染患者常有这些特点，而且从远离接种部位的神经组织中发现病毒。初次发病临床症状消退后，在神经内不再分离到感染性病毒。在细胞表面也检不出病毒蛋白。各种刺激因素，如免疫抑制、劳累、感染、精神创伤以及皮肤神经节创伤等都可引起病毒复活。

生殖器疱疹不仅在后期具有传染性，在潜伏期中也有传染性，患者总是在不知不觉得情形下传染了生殖器疱疹，HSV感染后平均约5日，表现为外阴患部先有灼热感，旋即发生成群丘疹，可为一簇或多簇，继之形成水疱。数日后可能演变为脓疱，破溃后形成糜烂或浅溃疡。

HSV2病毒既然有强大的传染性，只要与病患有过性接触的人，均有较大的几率感染到HSV2病毒。

临床上使用疱疹净，阿糖腺苷，无环鸟苷等杭病毒药物治疗HSV。感染时,常出现耐药现象,均难以清除病毒潜伏,因此HSV潜伏感染的机制已成为目前这方面的研究热点。鉴于预防和治疗HSV感染的重要性,所以研制疫苗是切实可行的有效方法,它能使机体在杭HSV感染免疫中,发挥体液免疫和细胞免疫功能来消除HSV感染。HSV疫苗的种类包括灭活全病毒疫苗,减毒活疫苗,亚单位疫苗,复制障碍HSV疫苗,DNA疫苗等。

1. 课题解决的问题
2. 提取及纯化重组单纯疱疹病毒蛋白（HSV2）
3. 对提取出的重组单纯疱疹病毒蛋白进行鉴定
4. 采用的研究手段及文献综述
5. 菌种保存：取扩大后的菌液，加600ul甘油，混匀
6. 接种：菌种解冻，超净台，200ml培养基，加入200ul氨苄青霉素，80ul菌种，充分混匀，封口，37℃，培养过夜，接种14瓶
7. 扩大：超净台，紫外灭菌，4瓶扩大成16瓶，37℃，180rmp，摇床培养 1.5h
8. 诱导：每瓶菌液加IPTG 40ul,诱导4h，25℃，180rmp
9. 收菌：菌液转移到离心杯中，8000rmp,离心20min，去上清得细胞碎片
10. 超声破碎：取适量PB裂解液加入离心杯中，搅拌后倒入烧杯，冰浴条件下超声破碎，破碎时间6s,间隔3s，循环75次
11. 提取粗蛋白：破碎后的菌液倒入离心杯，8000rmp,离心20min，取上清，抽滤去除残余细胞碎片
12. GST胶准备：加入1*PBS 溶液与胶混合，4℃冰箱静置备用
13. 蛋白与胶结合：将胶与抽滤得的蛋白质溶液混合，保鲜膜封口，磁力搅拌，4℃过夜
14. 将过夜的胶与蛋白溶液取出，抽滤，去滤液
15. 洗杂蛋白：配制杂蛋白洗脱液，分三次洗脱，每次加入后，搅拌10min，抽滤，保持胶湿润，存胶去液
16. 洗目的蛋白：配目的蛋白洗脱液，分三次洗脱，每次加入后，搅拌10min，抽滤，保持胶湿润，存液去胶。三次洗脱下来的溶液和混合后的溶液，分别侧OD值
17. 胶回收：3M NaCl 洗三次，1*PBS洗三次，加20%乙醇，混合倒出，4℃保存
18. 透析：4℃透析，磁力搅拌，每2h换一次透析液
19. 浓缩：透析后取出倒入小烧杯，测OD值，若量过大，OD值过低，则离心浓缩，
20. 装瓶，浓缩后得的蛋白质溶液装入小白瓶内4℃保存

参考文献：